Tổng quan sự phát triển của môi trường nuôi cấy
Việc phát hiện ra môi trường nuôi cấy đã cho phép phát triển vi sinh vật học vào thế kỷ XIX. Nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp đầu tiên được phát triển để nghiên cứu hệ vi sinh vật ở người, sử dụng môi trường nhân tạo cho phép phát triển và phân lập vi khuẩn.
Người đầu tiên nuôi cấy vi khuẩn theo cách có thể tái tạo là Louis Pasteur vào năm 1860 nhờ sự phát triển của cái gọi là môi trường nuôi cấy nhân tạo đầu tiên. Gần đây, sau sự xuất hiện của các kỹ thuật phân tử vào những năm 1970, chẳng hạn như PCR, giải trình tự và đặc biệt là metagenomics, các nhà vi sinh vật học đã ưa chuộng các kỹ thuật cải tiến này hơn là nuôi cấy.
Tuy nhiên, metagenomics có một số nhược điểm nhất định và đặc biệt là độ lệch về độ sâu, do thiếu độ nhạy của các đoạn mồi được sử dụng, vì nó không phát hiện ra vi khuẩn có nồng độ <105 vi khuẩn trên một gam phân. Hơn nữa, các kỹ thuật này chỉ phát hiện ra ADN: không thể phân biệt ADN thuộc về vi khuẩn sống với ADN của vi khuẩn tạm thời trong hệ vi sinh vật được nghiên cứu hoặc với ADN của vi khuẩn chết bằng các kỹ thuật này.
Một vài năm trước, culturomics, một kỹ thuật nuôi cấy mới sử dụng một số lượng lớn môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy để mở rộng danh mục vi khuẩn, đã được phát triển trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Kỹ thuật này chứng minh tính bổ sung giữa metagenomics và culturomics. Do đó, việc xác định metagenomic các loài vi khuẩn tồn tại trong một hệ vi sinh vật nhất định có thể được culturomics khai thác thông qua việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cụ thể mới để phân lập các loài này. Tính bổ sung này cho phép culturomics trở thành một kỹ thuật có mục tiêu.
Môi trường nuôi cấy mới ngày nay mô phỏng môi trường tự nhiên của vi khuẩn bằng cách thêm các thành phần khác nhau vào môi trường nuôi cấy để nuôi cấy các loại vi khuẩn trước đây chưa được nuôi cấy.
Chúng tôi đề xuất ở đây một bản tóm tắt tài liệu tham khảo về sự phát triển của môi trường nuôi cấy và sự phát triển của các kỹ thuật thông qua sự phát triển của vi sinh vật học theo thời gian.
Phương pháp tiếp cận thực nghiệm của vi sinh vật học
Vi sinh vật học quan sát
Vi sinh vật học được định nghĩa không chỉ bởi các sinh vật mà nó nghiên cứu mà còn bởi các công cụ được sử dụng để nghiên cứu chúng. Quan sát đầu tiên về vi khuẩn được thực hiện vào khoảng năm 1673 bởi nhà vi sinh vật học người Hà Lan Anton van Leeuwenhoek nhờ vào các kính hiển vi mà ông đã phát triển. Chúng được phóng to từ 50 đến 300 lần so với những gì ông quan sát được.
Trong quá trình nghiên cứu của mình, ông đã làm nổi bật các cấu trúc nhỏ mà ông gọi là ‘animalcules’, vì ông nghĩ rằng mình đang quan sát các loài động vật nhỏ. Trong suốt quá trình quan sát của mình, ông đã mô tả và vẽ các tế bào nấm men, nấm sợi, tảo cực nhỏ và động vật nguyên sinh. Leeuwenhoek cũng là người đầu tiên quan sát một loại ký sinh trùng, Giardia lamblia.
Tuy nhiên, chỉ riêng kính hiển vi không thể giải quyết được tất cả các câu hỏi về các vi sinh vật được nghiên cứu. Trong khoảng 200 năm, vi sinh vật học đã trì trệ cho đến khi phát triển các kỹ thuật phân lập vi khuẩn trong các nuôi cấy thuần túy. Đây là một cột mốc quan trọng khác trong lịch sử vi sinh học.
Vi sinh vật học “nuôi cấy”
Sự ra đời của dung dịch nước dùng nuôi cấy
Vào thế kỷ thứ mười ba, 400 năm trước Leeuwenhoek, một chất giống như máu xuất hiện trên bánh thánh. Theo đức tin của Cơ đốc giáo, chất màu đỏ này được cho là máu của Chúa Kitô.
Bartholomeo Bizio, một dược sĩ người Ý, đã giải quyết được bí ẩn này vào năm 1817 nhờ những tiến bộ trong vi sinh vật học và chỉ ra rằng đó không phải là máu mà là một vi sinh vật mà ông đặt tên là Serratia marcescens.
Vi khuẩn này xuất hiện dưới dạng các khuẩn lạc màu đỏ trên bánh mì khi được bảo quản trong bầu không khí ấm và ẩm. Đây là một trong những môi trường tự nhiên đầu tiên của một loại vi khuẩn. Nguồn gốc của môi trường nuôi cấy có từ thế kỷ XIX.
Nhiều nhà vi khuẩn học đã thử, với các mức độ thành công khác nhau, để nuôi cấy vi khuẩn trên thực phẩm hoặc vật liệu mà vi sinh vật được phát triển lần đầu tiên.
Sự phát triển của vi sinh vật học trở nên khả thi bằng cách thách thức lý thuyết về sự sinh sản tự phát, theo đó các sinh vật sống có thể phát triển từ vật chất chết hoặc đang phân hủy và do đó tự phát xuất hiện trong các nền văn hóa. Do đó, không thể hình dung được việc thu được các môi trường tinh khiết.
Năm 1861, Louis Pasteur, một nhà vi sinh vật học người Pháp, đã giải quyết vấn đề này thông qua một thí nghiệm. Ông đặt các dung dịch dinh dưỡng vào các bình, đốt nóng cổ bình bằng ngọn lửa và kéo căng chúng theo nhiều cách khác nhau, giữ cho đầu bình hở ra ngoài không khí. Pasteur đun sôi các dung dịch trong vài phút và làm nguội chúng. Không có sự phát triển nào xuất hiện ngay cả khi môi trường của các bình đã tiếp xúc với không khí. Pasteur nhận thấy rằng không có sự phát triển nào vì bụi và vi khuẩn đã bị mắc kẹt trên thành của các ống cong. Nếu các ống bị vỡ, sự phát triển sẽ bắt đầu ngay lập tức. Theo cách này, Pasteur không chỉ chứng minh rằng sự sinh sản tự phát là vô nghĩa mà còn tìm ra cách để giữ cho các dung dịch vô trùng.
Người đầu tiên nuôi cấy vi khuẩn có khả năng tái tạo trong môi trường nuôi cấy lỏng là Louis Pasteur. Năm 1860, ông đã phát triển một môi trường nuôi cấy chứa ‘súp nấm men’, tro, đường và muối amoni. Mục tiêu của ông là tạo ra một môi trường lên men để chứng minh rằng mỗi quá trình lên men (rượu, axetic, lactic…) đều liên quan đến sự phát triển của một vi sinh vật cụ thể.
Sự hiện diện của các nguyên tố khác nhau này trong môi trường cho phép ông quan sát thấy rằng một số thành phần này có thể thúc đẩy hoặc ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn nhất định và chúng cũng có thể cho phép một số vi khuẩn nhất định xuất hiện so với các thành phần khác.
Thật vậy, trong quá trình nghiên cứu quá trình lên men bia, ông đã phải đối mặt với một vấn đề: khi bia khỏe mạnh, kính hiển vi chỉ cho thấy men bia, nhưng khi bia có tính axit, Pasteur nhận thấy rằng các thùng chứa ‘các vật thể hình que nhỏ’ tạo ra axit lactic. Do đó, môi trường lên men này giúp làm nổi bật sự sinh sôi của vi khuẩn này.
Năm 1881, Robert Koch đã chứng minh được sự phát triển tối ưu của vi khuẩn khi chúng được ủ trong nước dùng gồm huyết thanh thịt bò tươi hoặc chiết xuất thịt. Tuy nhiên, việc sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng không tạo ra được các nền nuôi cấy vi khuẩn tinh khiết. Do đó, Koch đã tìm cách làm đông đặc môi trường.
Sự xuất hiện của các môi trường tinh khiết trong môi trường rắn
Đầu tiên, ông thử nghiệm albumin trứng đông tụ, hồ tinh bột hoặc một lát khoai tây cắt vô trùng. Tuy nhiên, không phải tất cả các kỹ thuật này đều cho phép ông phân lập các khuẩn lạc. Sau đó, Koch thêm gelatin vào nước dùng của mình và đổ toàn bộ lên một tấm thủy tinh phẳng. Tuy nhiên, gelatin có nhược điểm là nó hóa lỏng ở nhiệt độ trên 25°C và có thể bị gelatinase, một loại enzyme do một số loại vi khuẩn sản xuất ra, tiêu thụ.
Nhờ vợ của một trong những trợ lý của ông, Fannie Hesse, người đã sử dụng agar để làm đông mứt của mình, ông đã thay thế gelatin bằng agar, cho phép ông thu được agar cứng và phân lập vi khuẩn.
Năm 1887, Julius Richard Petri đã thay thế tấm thủy tinh bằng hộp nuôi cấy hình tròn, hộp đĩa Petri đã được tạo ra và vẫn được sử dụng cho đến ngày nay. Điều này cho phép ông thu được và quan sát các khuẩn lạc riêng lẻ và hạn chế ô nhiễm.
Làm thế nào để thiết kế môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng?
Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng là môi trường đã được bổ sung các nguyên tố cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn.
Các chất dinh dưỡng
Để phát triển, vi khuẩn cần tối thiểu các chất dinh dưỡng: nước, nguồn cacbon, nguồn nitơ và một số muối khoáng.
Nước
Nước đóng vai trò cơ bản trong việc hòa tan các chất dinh dưỡng, vận chuyển chúng và đảm bảo các phản ứng thủy phân. Một số vi khuẩn cần nước tự do để phát triển. Nếu xảy ra hiện tượng bốc hơi trong quá trình ủ thạch, có thể mất nước này, dẫn đến giảm kích thước khuẩn lạc và ức chế sự phát triển của vi khuẩn
Nguồn cacbon
Carbon là thành phần cấu thành dồi dào nhất trong vi khuẩn. Nó rất cần thiết để vi khuẩn sản xuất các phân tử carbon, chẳng hạn như chất béo, carbohydrate, protein và axit nucleic. Vi khuẩn có thể sử dụng các nguồn carbon vô cơ, chẳng hạn như carbon dioxide, hoặc các nguồn hữu cơ như đường và rượu.
Nguồn nitơ
Đối với các nguồn nitơ, chúng rất nhiều và có thể được tìm thấy trong một số lượng lớn các hợp chất được sử dụng trong thành phần của môi trường nuôi cấy. Nó được tìm thấy ở dạng hữu cơ, tương ứng với thủy phân protein, đặc biệt trong trường hợp thủy phân, proteose-peptone hoặc tryptone, nhưng cũng ở dạng vô cơ, nitrat. Nitơ cho phép vi khuẩn tổng hợp protein của chúng.
Cuối cùng, trong số các muối khoáng thông thường, phosphate, sulfat, magie hoặc canxi thường được tìm thấy.
Nguồn năng lượng
Có hai loại vi khuẩn, vi khuẩn quang dưỡng, chẳng hạn như Thiocapsa roseopersicina, sử dụng ánh sáng làm nguồn năng lượng bằng cách biến đổi nó thành một gradient điện hóa của các proton, và vi khuẩn hóa dưỡng, sử dụng năng lượng oxy hóa các hợp chất khoáng hoặc hữu cơ làm nguồn năng lượng. Trong số các loại vi khuẩn này, chúng ta có thể tìm thấy Listeria monocytogenes.
Các yếu tố tăng trưởng
Việc sử dụng môi trường tối thiểu không cho phép sự phát triển của một số loại vi khuẩn cần các yếu tố cụ thể để phát triển. Đôi khi cần phải thêm các yếu tố tăng trưởng vào môi trường nuôi cấy để thúc đẩy sự sinh sôi của vi khuẩn.
Các yếu tố tăng trưởng là các yếu tố mà vi khuẩn không thể tổng hợp từ các chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường. Các yếu tố tăng trưởng được yêu cầu với số lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy và nhu cầu của chúng được biện minh bằng sự vắng mặt hoặc chặn một con đường trao đổi chất trong vi khuẩn.
Các bazơ purin và pyrimidin
Có nhiều loại yếu tố tăng trưởng khác nhau trong đó chúng ta tìm thấy bazơ purin và pyrimidin. Chúng cần thiết cho quá trình tổng hợp axit nucleic. Thật vậy, một số vi khuẩn axit lactic cần adenin, guanin, thymin hoặc uracil để tăng trưởng. Đây là trường hợp đặc biệt đối với vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides, trong đó guanin là yếu tố cần thiết cho quá trình tăng trưởng của nó.
Axit amin
Axit amin cũng là các yếu tố tăng trưởng và được sử dụng để tổng hợp protein. Dunn et al. đã chỉ ra vào năm 1946 rằng chỉ có hai axit amin là cần thiết cho Leuconostoc mesenteroides , axit glutamic và valine, trong khi đối với Lactobacillus brevis, không dưới 15 axit amin là cần thiết cho sự tăng trưởng của nó.
Nhu cầu cao về axit amin này có thể được giải thích bởi thực tế là môi trường cơ bản được sử dụng tại thời điểm đó không giàu chất dinh dưỡng thông thường. Thật vậy, ngày nay, Lactobacillus brevis phát triển trên COS agar (Columbia Blood Agar) (Biomérieux, Marcy l’Étoile, Pháp), không bổ sung axit amin, mà bao gồm thủy phân casein và peptone proteose, bản thân chúng là nguồn axit amin.
Vitamin
Vitamin cũng là một phần của các yếu tố tăng trưởng. Chúng là coenzyme hoặc tiền chất của coenzyme. Vitamin là một chất hữu cơ, cần thiết với số lượng nhỏ cho quá trình trao đổi chất của một sinh vật sống, mà sinh vật đó không thể tổng hợp đủ số lượng. Faecalibacterium prausnitzii , là một loại vi khuẩn khó tính, cần một số lượng lớn vitamin để phát triển, chẳng hạn như biotin, axit folic, riboflavin hoặc vitamin B12. Vi khuẩn này cũng cần sự hiện diện của các yếu tố tăng trưởng khác như axit béo dễ bay hơi (axit axetic, axit propionic hoặc axit valeric).
Sử dụng máu và các sản phẩm từ máu
Máu và các dẫn xuất của nó cũng sẽ thúc đẩy sự phát triển của một số loại vi khuẩn nhất định. Trong môi trường nuôi cấy, người ta thường sử dụng máu cừu hoặc máu ngựa.
Vai trò của máu là hoạt động như một tác nhân bảo vệ chống lại các gốc oxy độc hại, nhưng cũng là một chất bổ sung dinh dưỡng.
Ví dụ, máu cừu nấu chín cung cấp yếu tố X (haem) cần thiết cho sự phát triển của nhiều loài gây bệnh, bao gồm Haemophilus influenzae.
Thông thường, 5% máu được thêm vào môi trường nuôi cấy. Huyết thanh, chẳng hạn như huyết thanh bê hoặc cừu non, cũng có thể được sử dụng làm yếu tố tăng trưởng bằng cách cung cấp một số lượng lớn các nguyên tố như lipid, vitamin, triglyceride, khoáng chất và các nguyên tố khác. Máu này đã được làm sạch các tế bào, tiểu cầu và các yếu tố đông máu.
Huyết thanh bê thai nhi, thường được sử dụng nhất trong vi sinh học, phải được vô hiệu hóa bằng nhiệt trước khi sử dụng (56°C trong 30 phút) để vô hiệu hóa tất cả các thành phần của hệ thống bổ sung có trong huyết thanh này. Nó phải được bảo quản ở nhiệt độ -20°C và đun nóng đến nhiệt độ phòng thay vì trong bồn nước để tránh làm hỏng các protein chứa trong nó.
Dịch dạ cỏ
Cuối cùng, cũng có thể sử dụng dịch dạ cỏ (Rumen fluid) để thúc đẩy sự phát triển của một số loài vi khuẩn nhất định bằng cách mô phỏng môi trường tự nhiên của chúng.
Dịch dạ cỏ được sử dụng tương ứng với dịch dạ cỏ của cừu. Để chế biến dịch này, trước tiên cần thu hồi dịch từ thực vật lên men trong dạ dày bằng cách lọc qua vải mịn. Sau đó, dịch này được ly tâm (10.000 vòng/phút trong 90 phút) và thu được phần dịch nổi. Sau đó, dịch này trải qua ba lần lọc liên tiếp ở 0,8 μm, 0,45 μm và 0,22 μm.
Thường thêm 5% dịch dạ cỏ vào môi trường nuôi cấy. Dịch dạ cỏ có thể thúc đẩy sự phát triển của một số loài Treponema nhất định, chẳng hạn như Treponema hyodysenteriae và Treponema innocens.
Chất chống oxy hóa
Một số vi khuẩn kỵ khí rất khó nuôi cấy và các chiến lược nuôi cấy mới đã được phát triển để phân lập chúng. Thật vậy, vi khuẩn kỵ khí có nhiều nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của con người, chiếm tới 99,9% tổng số vi khuẩn và cực kỳ nhạy cảm với oxy, chất độc đối với chúng. Do đó, chất chống oxy hóa đã được thêm vào môi trường nuôi cấy để cho phép nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt trong điều kiện hiếu khí.
Một số chất chống oxy hóa đã được thử nghiệm và cho thấy kết quả khả quan. Đây là trường hợp của axit ascorbic và glutathionehoặc axit uric. Việc bổ sung các chất chống oxy hóa này vào môi trường nuôi cấy và ủ trong điều kiện hiếu khí đã cho phép phát triển 135 vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt, 12 vi khuẩn vi hiếu khí và 22 vi khuẩn hiếu khí nghiêm ngặt.
Làm thế nào chúng ta có thể có được môi trường nuôi cấy chọn lọc?
Môi trường nuôi cấy chọn lọc được sử dụng để phân lập một loài hoặc chi vi khuẩn cụ thể. Sau khi thêm một số chất ức chế vào môi trường nuôi cấy, mục tiêu của loại môi trường này là loại bỏ hệ vi khuẩn không mong muốn. Môi trường chọn lọc bao gồm một môi trường cơ bản mà kháng sinh, hóa chất, thuốc nhuộm, thuốc sát trùng, muối natri hoặc phage có thể được thêm vào.
Thuốc kháng sinh
Kháng sinh là tác nhân chọn lọc được sử dụng phổ biến nhất. Phổ tác dụng của các thuốc kháng sinh được biết rõ nên dễ dự đoán tác dụng của chúng lên vi khuẩn hơn.
Có rất nhiều loại kháng sinh có thể được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, một số trong số đó được gọi là kháng khuẩn vì chúng nhắm vào vi khuẩn và một số khác là kháng nấm vì chúng tiêu diệt nấm và nấm men. Một số phân tử nhắm vào vi khuẩn Gram dương, chẳng hạn như penicillin G, bacitracin hoặc vancomycin, trong khi những phân tử khác nhắm vào vi khuẩn Gram âm, chẳng hạn như colistin hoặc polymixin B. Amphotericin B, cycloheximide hoặc nystatin có tác dụng chống lại nấm và nấm men. Một số loại kháng sinh có thể được kết hợp để có được môi trường chọn lọc hơn.
Thuốc sát trùng
Thuốc sát trùng ít được sử dụng hơn trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, cetrimide hoặc acriflavin có thể được tìm thấy trong một số môi trường nuôi cấy.
Chlorhexidine có thể được sử dụng để chọn Mycobacterium tuberculosis. Ethanol cũng có thể chọn lọc các loài vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn bào tử như Clostridioides difficile.
Cetrimide Agar Base là môi trường nuôi cấy được sử dụng để phân lập và xác định có chọn lọc Pseudomonas aeruginosa. Cetrimide là amoni bậc bốn ức chế một số lượng lớn vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, ngoài Pseudomonas aeruginosa.
Muối natri
Muối natri được biết đến với đặc tính ức chế của chúng. Muối được biết đến nhiều nhất là natri clorua, được sử dụng để chọn vi khuẩn ưa muối có khả năng chống lại lượng muối rất cao. Ngoài ra, natri deoxycholate có tác dụng dung môi mạnh đối với vi khuẩn.
Môi trường nuôi cấy Marine Agar 2216E được sử dụng để đếm vi khuẩn dị dưỡng biển. Nó bao gồm nồng độ muối cao, giúp loại bỏ một lượng lớn vi khuẩn và bảo quản vi khuẩn biển quan tâm.
Chất hóa học
Các chất hóa học có thể được thêm vào môi trường nuôi cấy để ức chế một số vi khuẩn. Các chất ức chế này bao gồm kali tellurit và muối mật, có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram dương hoặc liti clorua, có tác dụng loại bỏ vi khuẩn Gram âm.
Brayton et al. đã tạo ra một môi trường nuôi cấy chọn lọc cho Vibrio vulnificus, một loại vi khuẩn ưa mặn gây bệnh. Môi trường này, thạch VV, bao gồm, trong số những thứ khác, kali tellurit như một tác nhân chọn lọc để ức chế Enterobacteriaceae.
Thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm có thể được sử dụng như một chất chỉ thị màu trong môi trường nuôi cấy hoặc như một tác nhân chọn lọc chống lại một số loại vi khuẩn nhất định. Tím tinh thể là một trong những thuốc nhuộm được sử dụng phổ biến nhất để ức chế vi khuẩn. Xanh malachite và xanh methylen cũng được sử dụng để ức chế vi khuẩn Gram dương và Gram âm và vi khuẩn Gram dương.
Một môi trường chọn lọc Streptococcus pneumoniae đã được phát triển, chứa tinh thể tím. Thuốc nhuộm này được sử dụng để chọn lọc streptococci và ức chế staphylococci cũng như các vi khuẩn Gram dương khác.
Thực khuẩn thể
Thực khuẩn thể (phage) là loại virus đặc hiệu của vi khuẩn có thể lây nhiễm và thậm chí tiêu diệt vi khuẩn, trong trường hợp của thực khuẩn thể ly giải. Để phân lập Mycobacterium tuberculosis, việc sử dụng lysin thực khuẩn thể khử nhiễm đờm của các vi khuẩn khác có trong hệ vi sinh vật phổi.
Sillankorva et al. đã nghiên cứu về các bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu vĩnh viễn do Escherichia coli. Để điều trị các bệnh nhiễm trùng này, họ đã thử nghiệm các loại thực khuẩn thể khác nhau (thực khuẩn thể T1, T4 và giống φX174) chống lại E. coli. Sau 2 giờ điều trị, thực khuẩn thể T1 đã giảm 45% quần thể E. coli, chứng minh hiệu quả của tác nhân chọn lọc này.
Nhược điểm của việc sử dụng chất tạo gel
Môi trường nuôi cấy lỏng so với môi trường nuôi cấy rắn
Có hai loại môi trường nuôi cấy chính: lỏng và rắn.
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, còn gọi là môi trường nuôi cấy, các chất dinh dưỡng được hòa tan trong nước. Sự phát triển của vi khuẩn trong loại môi trường này có thể được chứng minh bằng sự xuất hiện của độ đục trong môi trường, mặc dù điều này không phải lúc nào cũng xảy ra. Thật khó để phân lập một loại vi khuẩn cụ thể trong loại môi trường này. Thật vậy, các vi khuẩn thu được từ một mẫu được cấy vào môi trường nuôi cấy đều được trộn lẫn với nhau. Ngoài ra, loại môi trường nuôi cấy này không cho phép xác định các đặc điểm hình thái của các loài vi khuẩn.
Tuy nhiên, môi trường nuôi cấy lỏng tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tiếp cận chất dinh dưỡng. Các chất dinh dưỡng này càng dễ tiếp cận hơn khi môi trường nuôi cấy được ủ trong điều kiện khuấy, cho phép tái tạo chất dinh dưỡng cho vi khuẩn.
Môi trường nuôi cấy rắn thu được bằng cách thêm chất tạo gel, chẳng hạn như agar, vào môi trường nuôi cấy. Chúng giúp thu được các khuẩn lạc riêng biệt của các loài vi khuẩn khác nhau, có thể được xác định. Các đặc điểm hình thái khác nhau của vi khuẩn có thể được mô tả từ các nuôi cấy này. Tuy nhiên, trong môi trường nuôi cấy rắn, khả năng tiếp cận chất dinh dưỡng của vi khuẩn có thể bị hạn chế. Môi trường có hàm lượng gel cao, chẳng hạn như agar, sẽ tạo thành các khuẩn lạc nhỏ hơn môi trường có hàm lượng gel thấp vì dòng chất dinh dưỡng và quá trình loại bỏ độc tố bị giảm.
Ngoài ra, người ta đã chỉ ra rằng agar, với số lượng quá nhiều, có thể ức chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn, làm nổi bật nhu cầu tìm kiếm các tác nhân tạo gel khác.
Các chất tạo gel khác nhau
Một trong những tác nhân tạo gel đầu tiên được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là gelatin. Vấn đề với tác nhân tạo gel này là nó tan chảy ở 37°C, đây là nhiệt độ ủ của hầu hết các loại vi khuẩn. Hơn nữa, sự hiện diện của một loại enzyme trong một số loại vi khuẩn, gelatinase, gây ra quá trình tiêu hóa gelatin và do đó phân hủy nó.
Agar sau đó đã được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, việc tiêu thụ quá nhiều agar đã dẫn đến việc giảm nguồn nguyên liệu sản xuất, chính là tảo đỏ, qua đó làm tăng chi phí. Ngoài ra, agarase, có trong một số loại vi khuẩn, phá hủy agar, ngăn cản việc phân lập các vi khuẩn này. Ngoài ra, agar có thể ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn kỵ khí vì các hợp chất ức chế tăng trưởng có thể được tạo ra từ quá trình hấp khử trùng phosphate bằng agar. Cuối cùng, agar có thể gây ức chế PCR DNA nấm khi được chiết xuất trực tiếp từ môi trường nuôi cấy rắn.
Vì tất cả những lý do này, các tác nhân tạo gel mới đã được tìm kiếm. Các tác nhân tạo gel này bao gồm κ-carrageenan, ι-carrageenan, natri alginate, pectin có hàm lượng methoxyl cao và methoxyl thấp và kẹo cao su gellan. Tất cả các tác nhân tạo gel này đều có các đặc tính khác nhau và nhu cầu tạo gel cụ thể.
Kẹo cao su Carrageenanκ-carrageenan và ι-carrageenan là một phần của carrageenan gum.
Đầu tiên sẽ tạo thành một gel cứng với khối lượng tích tụ nhanh khi kết hợp với các ion kali. Nó cho phép một số vi khuẩn phát triển. Chất tạo gel này chống lại các giá trị pH rất kiềm trên 12,5, do đó có thể phân lập các vi khuẩn ưa kiềm rất cao. Nó có thể được sử dụng để thay thế agar vì nhiều vi khuẩn phát triển trên môi trường dựa trên κ-carrageenan.
ι-carrageenan hiếm khi được sử dụng vì nó tạo ra gel đàn hồi khiến việc nuôi cấy vi khuẩn trở nên khó khăn.
Natri alginat: Chất tạo gel này được sản xuất từ chiết xuất rong biển nâu và tạo thành gel mềm dẻo khi có ion canxi. Tuy nhiên, chất tạo gel này không tạo ra gel đủ chắc để nuôi cấy vi khuẩn
Pectin methoxyl cao và methoxyl thấpPectin có hàm lượng methoxyl cao cần đường và độ axit cao để tạo gel. Quá trình đông gel diễn ra chậm và tạo thành gel ‘có thể phết’.
Pectin có hàm lượng methoxyl thấp tạo thành gel giòn khi có sự hiện diện của Ca 2+
Kẹo cao su GellanKẹo cao su Gellan là một polysaccharide được sản xuất bởi một chi vi khuẩn, Sphingomonas spp. Theo Tamaki et al., 108 vi khuẩn được thử nghiệm trên môi trường có kẹo cao su gellan làm chất tạo gel đã cho thấy sự phát triển.
Việc sử dụng các tác nhân tạo gel khác nhau này có thể cho phép nuôi cấy vi khuẩn mới, không phát triển trên thạch, chẳng hạn như do sự hiện diện của agarase hoặc do thạch tạo thành mạng lưới quá dày đặc khiến một số vi khuẩn không thể di chuyển và phát triển tối ưu.
Kích thước khuẩn lạc
Lượng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường nuôi cấy sẽ quyết định kích thước của các khuẩn lạc vi khuẩn. Môi trường nuôi cấy quá đặc, do nồng độ chất tạo gel cao, sẽ làm giảm dòng chảy của chất dinh dưỡng và do đó làm giảm khả năng tiếp cận các chất dinh dưỡng này của vi khuẩn.
Mặt khác, trong một số môi trường nuôi cấy, lượng chất dinh dưỡng có sẵn quá cao và có thể gây độc cho một số loại vi khuẩn cần môi trường nuôi cấy kém để phát triển. Các khuẩn lạc nhỏ là các khuẩn lạc hầu như không nhìn thấy được bằng mắt thường (đường kính từ 100 đến 300 μm). Để có được các khuẩn lạc lớn hơn, đôi khi cần phải mô phỏng môi trường tự nhiên của vi khuẩn bằng cách cung cấp cho nó các nguyên tố cụ thể. Ví dụ, đây là trường hợp của Phascolarctobacterium faecium và Phascolarctobacterium succinatutens, chúng tạo thành các khuẩn lạc nhỏ. Tuy nhiên, khi môi trường được bổ sung succinate, các khuẩn lạc có đường kính từ 0,8 đến 1,2 mm.
Kết luận
Sau thời kỳ trì trệ trong việc phát triển các kỹ thuật nuôi cấy mới, do sự tiến hóa nhanh chóng của các phương pháp vi sinh vật học mới như metagenomics, nuôi cấy vi khuẩn đang trải qua một sự bùng nổ mới. Trong những năm gần đây, culturomics, với việc sử dụng môi trường nuôi cấy mới và các điều kiện nuôi cấy mới, đã cho phép làm giàu danh mục vi khuẩn thông qua việc phân lập các loài vi khuẩn mới. Điều này cho thấy rằng, mặc dù nhiều nhà vi sinh vật học đã từ bỏ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy vẫn là một công cụ cơ bản cho các nhà vi khuẩn học để phân lập vi khuẩn cộng sinh cũng như vi khuẩn gây bệnh.
Nghiên cứu môi trường tự nhiên của vi khuẩn vẫn chưa được nuôi cấy cho đến nay sẽ rất thú vị vì nó sẽ cung cấp các yếu tố thiết yếu để vi khuẩn phát triển. Thật vậy, mặc dù có nhiều môi trường nuôi cấy được làm giàu, nhưng mỗi loại vi khuẩn đều độc đáo và có các yêu cầu cụ thể. Việc sử dụng các tác nhân tạo gel mới cũng có thể cho phép phân lập các loài mới mà thạch không phù hợp để phát triển. Mặc dù nhiều tác nhân tạo gel đã được thử nghiệm, nhưng một số ít vẫn được sử dụng trong môi trường nuôi cấy thương mại và do đó trong các phòng thí nghiệm. Do đó, vẫn còn nhiều sự phát triển trong nuôi cấy vi khuẩn, giúp làm giàu kho vi khuẩn và hiểu rõ hơn về một số bệnh nhất định.
Ngoài ra, các vi khuẩn nội bào như Coxiella burnetii hoặc Tropheryma whipplei cần một tế bào chủ để tồn tại và sinh sôi. Một số vi khuẩn này gây ra các bệnh nghiêm trọng và đặt ra vấn đề chẩn đoán do chúng phát triển khó tính hoặc không phát triển trên môi trường thông thường. Sẽ rất thú vị khi phát triển các môi trường nuôi cấy cho phép phát hiện nhanh hơn và dễ dàng hơn các vi khuẩn này. Ngoài ra, vì hệ vi sinh vật đóng vai trò ngày càng quan trọng đối với sức khỏe con người, nên sự phát triển của men vi sinh đang gia tăng. Do đó, việc sử dụng môi trường nuôi cấy có mục tiêu để chọn lọc một số vi khuẩn có vai trò y tế quan trọng vẫn là ưu tiên hàng đầu.
(*) Dịch từ bài viết gốc: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6961714/
Xem thêm:
- Tổng quan về môi trường nuôi cấy
- Môi trường PDA
- Môi trường tryptone soya agar
- Môi trường LB
- Kỹ thuật pha loãng nối tiếp trong nuôi cấy vi sinh vật