Môi trường LB, còn được gọi là LB Broth, Lysogenia Broth hoặc Luria-Bertani, là môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng thường được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn.
Môi trường LB đã là tiêu chuẩn công nghiệp cho việc nuôi cấy Escherichia coli từ những năm 1950.
Môi trường LB thích hợp cho việc nuôi cấy không chọn lọc các chủng E. coli để nhân dòng, sản xuất ADN plasmid và sản xuất protein tái tổ hợp. LB Broth cũng thích hợp cho việc nhân giống chọn lọc khi bổ sung kháng sinh đặc hiệu để duy trì và nuôi cấy các chủng E. coli tái tổ hợp trong phòng thí nghiệm.
Tuy nhiên, đối với các nghiên cứu sinh lý, việc sử dụng môi trường LB không được khuyến khích.
Lịch sử ra đời môi trường LB
Ngày nay, LB là môi trường nuôi cấy vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong Sinh học phân tử và công nghệ lên men, nhưng xuất phát điểm ban đầu lại có nguồn gốc từ trong lĩnh vực di truyền thực khuẩn.
Công thức môi trường LB được công bố vào năm 1951 trong bài báo đầu tiên của Bertani về khả năng sinh lý.
Nhà khoa học Guiseppi Bertani đã tạo ra công thức môi trường LB trong khi cố gắng tối ưu hóa sự hình thành mảng bám trên chủng chỉ thị Shigella (Bertani, 1952).
Theo Bertani, LB đã được bị hiểu sai là viết tắt của các tên gọi “Luria Broth”, “Luria-Bertani” và “Lennox Broth”; tuy nhiên, từ viết tắt ban đầu là viết tắt của “Lysogeny Broth” (Bertani, 2004).
Dạng thạch của môi trường nên được chỉ định là LA (với ý nghĩa là LB + Agar) nhưng đa số mọi người thường gọi là LB. Mặc dù ban đầu được phát triển cho các nghiên cứu về thực khuẩn và Shigellagrowth, Môi trường LB sau đó trở thành môi trường được lựa chọn cho sự phát triển của Escherichia coli và các vi khuẩn đường ruột khác có liên quan.
Thành phần môi trường LB
Có một số công thức phổ biến của LB. Mặc dù chúng khác nhau nhưng nhìn chung chúng có thành phần tương tự nhau về các thành phần được sử dụng để thúc đẩy tăng trưởng, bao gồm:
- Peptide và pepton casein
- Vitamin (bao gồm vitamin B)
- Các nguyên tố vi lượng (ví dụ nitơ, lưu huỳnh, magiê)
- Khoáng chất
Peptide và peptone được cung cấp bởi tryptone. Vitamin và một số nguyên tố vi lượng được cung cấp bởi chiết xuất nấm men. Các ion natri để vận chuyển và cân bằng thẩm thấu được cung cấp bởi natri clorua. Tryptone được sử dụng để cung cấp các axit amin thiết yếu cho vi khuẩn đang phát triển, trong khi chiết xuất nấm men được sử dụng để cung cấp rất nhiều hợp chất hữu cơ hữu ích cho sự phát triển của vi khuẩn.
Trong bài báo ban đầu năm 1951 của mình, Bertani đã sử dụng 10 gam NaCl và 1 gam glucose cho mỗi 1 L dung dịch.
Sau đó, vào năm 1957, nhà khoa học Luria đã sao chép chính xác công thức ban đầu của Bertani để tạo ra môi trường L Broth. Các công thức môi trường LB được xuất bản sau này thường không chứa glucose.
Các công thức môi trường LB thường khác nhau về lượng Natri Clorua, do đó cung cấp sự lựa chọn các điều kiện thẩm thấu thích hợp cho chủng vi khuẩn cụ thể và điều kiện nuôi cấy mong muốn. Công thức ít muối, Lennox và Luria, lý tưởng cho các môi trường nuôi cấy cần kháng sinh nhạy cảm với muối.
Hiện nay có 3 công thức phổ biến của LB với sự điều chỉnh hàm lượng Natri Clorua, bao gồm:
- LB Miller (10 g/L NaCl)
- LB Lennox (5 g/L NaCl)
- LB Luria (0.5 g/L NaCl)
Công thức LB Miller là công thức phổ biến hoặc tiêu chuẩn hơn của LB. Các công thức thay thế của LB chủ yếu khác nhau về nồng độ NaCl, do đó cho phép lựa chọn các điều kiện thẩm thấu thích hợp và điều kiện nuôi cấy mong muốn.
Môi trường LB có sẵn ở dạng bột, nước dùng hoặc dạng sẵn sàng để sử dụng.
*** Xem thêm: Tổng quan về môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Các biến thể môi trường LB
Có nhiều biến thể và chất phụ gia có thể được thêm vào môi trường LB để xác định hoặc lựa chọn quần thể sinh vật.
Thông thường, một loại kháng sinh được thêm vào môi trường khử trùng để chọn lọc các tế bào chứa yếu tố di truyền cụ thể như plasmid, transposon hoặc sự gián đoạn gen thông qua băng kháng kháng sinh.
Công thức ít muối, Lennox và Luria, lý tưởng cho các loại cây trồng cần kháng sinh nhạy cảm với muối như Zeocin.
Để phân lập các vi sinh vật biển như Vibrio spp., một số nhà nghiên cứu đã sử dụng 30 gam/lít NaCl
Để tối đa hóa sự tăng trưởng, đặc biệt khi bổ sung nguồn carbon như glucose, đệm photphat hoặc đệm Tris-HCl có thể được thêm vào để duy trì độ pH.
Nếu môi trường được sử dụng cho sự phát triển của thực khuẩn, dung dịch gốc CaCl2 vô trùng thường được thêm vào sau khi hấp khử trùng.
Hướng dẫn chuẩn bị môi trường LB
Sau đây là phương pháp phổ biến để pha chế 1 lít LB:
B1: lần lượt cân các nguyên liệu thành phần
- 10 g trypton
- 5 g chiết xuất men
- 10 hoặc 5 hoặc 0,5 g NaCl theo yêu cầu (xem Công thức ở trên; một số vi khuẩn nhạy cảm với NaCl)
B2: Hòa tan các nguyên liệu trong khoảng 800 ml nước cất hoặc nước khử ion.
B3: Thêm nước cất hoặc nước khử ion vào ống đong để đảm bảo độ chính xác, tổng thể tích là 1 lít.
B4: Hấp tiệt trùng ở 121°C trong 20 phút.
B5: Sau khi làm nguội, xoay bình để đảm bảo trộn đều và LB đã sẵn sàng để sử dụng.
Điều chỉnh độ pH
Trước khi hấp khử trùng, một số phòng thí nghiệm điều chỉnh độ pH của LB đến 7,5 hoặc 8 bằng natri hydroxit.
Tuy nhiên, natri hydroxit không cung cấp bất kỳ khả năng đệm nào cho môi trường và điều này dẫn đến sự thay đổi nhanh chóng độ pH trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn.
Để giải quyết vấn đề này, một số phòng thí nghiệm thích điều chỉnh độ pH bằng dung dịch đệm TRIS 5-10 mmol/L , được pha loãng từ dung dịch TRIS 1 mol/L ở độ pH mong muốn.
Tuy nhiên, không nhất thiết phải điều chỉnh độ pH trong hầu hết các trường hợp. Một số phòng thí nghiệm điều chỉnh độ pH đến 7,0 chỉ để phòng ngừa.
Vì việc đệm bằng TRIS phần lớn sẽ không hiệu quả khi đối mặt với sự phát triển đáng kể của vi khuẩn nên việc điều chỉnh độ pH của LB theo cách đặc biệt này thường là không cần thiết.
Do đó, việc sử dụng TRIS trong một số công thức nấu nước dùng (đặc biệt khi môi trường nuôi cấy được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian dài) có thể được coi là một quy trình mê tín không có nhiều giá trị khoa học.